一、 原理
T淋巴細胞膜上具有異種動物紅細胞的受體,可與綿羊等動物的紅細胞(E)結(jié)合形成花環(huán);B淋巴細胞膜上具有補體C3b受體,可與補體C3b致敏的酵母菌細胞(Y)形成花環(huán);D細胞膜上具有以上兩種受體,故可同時與動物紅細胞、補體C3b致敏的酵母細胞形成混合花環(huán);N細胞無以上兩種受體,不形成花環(huán)。此試驗可同時檢測T淋巴細胞、B淋巴細胞、D細胞及N細胞,借以了解機體細胞免疫和體液免疫水平。
二、 材料和方法
(一) 材料
家兔脫纖血液,酵母多糖試劑,新鮮小鼠血清,豚鼠肝素抗凝血,滅活小牛血清,025%戊二醛,Hanks液及生理鹽水,姬姆薩氏染液與瑞氏染液。
(二) 方法
1 1%家兔紅細胞懸液的制備取脫纖血,用Hanks液洗3次,zui后一次用刻度尖底離心管,以2 000~2 500 r/min離心15min,棄去上清,用Hanks液配成1%(V/V)懸液,計算細胞數(shù),調(diào)至4×108/ml備用。
2 C3b致敏酵母細胞懸液的制備取酵母多糖試劑用生理鹽水洗2次,zui后一次用刻度尖離心管2 000~2 500 r/min離心10min,用生理鹽水配成1%懸液,再與等量小鼠血清充分混合均勻,置37℃水浴15min,其間不斷搖晃,以使其充分作用。之后用生理鹽水洗1次,再用生理鹽水配成1%懸液,計算細胞數(shù),調(diào)至1×108/ml備用。
3 淋巴細胞懸液的制備
(1) 取豚鼠肝素抗凝血2ml,加等量Hanks液進行稀釋,輕輕加入裝有2 ml淋巴細胞分層液的試管上層,注意使之不要與分離液混合。
(2) 置水平離心機上以2000~2500 r/min離心15min,使淋巴細胞與紅細胞分開。吸取淋巴細胞層,用Hanks液洗1次,棄去上清,沉淀物懸浮后計數(shù),用Hanks液調(diào)細胞數(shù)至1×107/ml備用。
4 花環(huán)形成試驗
(1) 于同一試管中加入1×107/ml的淋巴細胞懸液、滅活小牛血清、1×108/ml C3b致敏酵母細胞懸液和4×108/ml家兔紅細胞懸液各2滴,充分混勻,置37℃水浴15min,取出后以500 r/min離心5min,置4℃冰箱過夜。
(2) 取出后,吸棄少許上清,用腕力輕輕懸浮后,加入025%戊二醛1小滴,再充分混勻,涂片,自然干燥,甲醇固定,再用姬姆薩氏染液與瑞氏染液分步染色:先將姬姆薩氏染液用pH值64 PBS稀釋一倍,染1~2min后水洗,再加用pH值64 PBS稀釋一倍的瑞氏染液,染1~2min,水洗干燥后,用油浸鏡或高倍鏡觀察計數(shù)。
三、 結(jié)果
鏡檢計數(shù),見粘附3個以上紅細胞者為T淋巴細胞;粘附3個以上C3b致敏酵母細胞者為B淋巴細胞;同時粘附2個以上紅細胞和2個以上C3b致敏酵母細胞者為D細胞;無細胞粘附者為N細胞或其它細胞。計數(shù)200個淋巴細胞,算出各種細胞的百分率。有資料表明:豚鼠EY混合玫瑰花環(huán)中,T細胞20%,B細胞8%,D細胞1%,其它細胞為62%。
四、 注意事項
1 酵母多糖(zymosan)是從酵母細胞中提取的一種脂多糖,在體外能激活血清補體的旁路途徑,并與裂解的補體C3b結(jié)合形成酵母多糖補體復合物。應用的小鼠血清為多個體的血清混合物,并要求血清新鮮。
2 本試驗條件要求固定,被檢淋巴細胞、C3b致敏酵母細胞、紅細胞的比例,控制在1∶10∶40水平上。比例過大或過小,形成花環(huán)率都不準。這可能與淋巴細胞表面受體的數(shù)量有關(guān)。
3 在不吸附任何細胞的其它細胞中,除N細胞外,可能還包括幼稚型的T、B淋巴細胞和其它沒有紅細胞和C3b受體的細胞以及沒有粘附的T、B淋巴細胞。
4 加入戊二醛主要是起偶聯(lián)作用,過多會使玫瑰花環(huán)率升高,加入時要控制用量。戊二醛用pH值64 PBS稀釋。
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