酶標(biāo)記抗體法和熒光素標(biāo)記抗體法的原理類似,分為直接法和間接法,其原理基本相同,但敏感性不同。
(一)直接法
直接法是將酶(如HRP)標(biāo)記在特異性抗體(*抗體)上,然后用酶標(biāo)記抗體直接與相應(yīng)原特異性結(jié)合,形成抗原—抗體—HRP復(fù)合物,zui后用酶底物DAB-H202顯色。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、步驟少,省時(shí)、特異性高、非特異性染色輕:缺點(diǎn)是敏感性差,因?yàn)橐粋€(gè)抗原決定簇只結(jié)合一個(gè)HRP分子(假設(shè)一個(gè)抗體分子與一個(gè)HRP分子結(jié)合)。另外,一種標(biāo)記抗體也只能檢測(cè)一種抗原。若要檢測(cè)多種抗原,就必須標(biāo)記每一種特異抗體,這樣既麻煩又不經(jīng)濟(jì)。目前此法很少應(yīng)用,但在單克隆抗體制備過程中,為了更特異地篩選單抗,仍常用此法。
(二)間接法
間接法也稱夾心法,是直接法的簡(jiǎn)單改進(jìn),將酶示蹤物標(biāo)記在二抗上,再與*抗體(已與相應(yīng)抗原反應(yīng)形成復(fù)合物的IgG)反應(yīng),然后進(jìn)行顯色反應(yīng)。此法要求第二抗體與特異性抗體(一抗)應(yīng)是不同種屬的動(dòng)物產(chǎn)生,如特異性抗體(一抗)是兔抗人IgG,酶標(biāo)記抗體(二抗)則可以是羊抗兔抗體。該法與直接法比較有以下優(yōu)點(diǎn):
①應(yīng)用面較寬,僅標(biāo)記一種二抗就可以檢測(cè)眾多相同的*抗體,例如眾多一抗為兔來源,只要標(biāo)記一種抗兔二抗就可用于所有抗兔一抗的檢測(cè),不需要對(duì)每種特異性抗體進(jìn)行標(biāo)記;
②敏感性增加,*抗體的工作濃度在直接法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步稀釋;
③可以商品化購置;
④可以設(shè)計(jì)各種對(duì)照。
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