實驗室在進行血清抗體檢測時,尤其是在疫情發(fā)生情況下,必須采取一些措施防止操作人員感染NiV。血清可以用伽馬射線(6kGy)照射或者用含有0.5%tween-20和0.5%的triton-X100的PBS稀釋后56~0作用30min進行病毒滅活。
(1)VNT法檢測血清抗體。VNT法檢測血清抗體采用引起50%細胞培養(yǎng)孔發(fā)生CPE的TCID5。判定法。將待測血清和標準NiV病毒液作用后再加到含有Vero細胞的96孔板中,3天后進行觀察。CPE被*抑制的孔判為陽性孔。血清從1:2開始稀釋進行檢測。由于血清本身也會引起CPE,如果血清本身CPE干擾性太強,可以先讓待測血清和標準的病毒液在37~C作用10rain,然后將此混合液和細胞在37~C作用45min,再傾去此混合液,以減輕血清本身CPE的干擾。對于質量不好的血清,或者量少的血清(如蝙蝠等動物的血清)可以從1:5開始稀釋。
被檢血清在10倍以上稀釋時能夠*抑止CPE,判定為陽性;被檢血清在2-10倍之間稀釋時能夠*抑止CPE的,判為疑似;其他情況判為陰性。
(2)ELISA法檢測血清抗體。血清中抗NiV抗體ELISA檢測所用的抗原一般用NiV感染的Vero細胞制備,有些血清樣品用此抗原檢測背景值很高,須用正常Vero細胞裂解液作為對照抗原,檢測這些血清的背景值,zui終以檢測值和背景值的比值作為判定依據(jù)。國家外來動物疫病診斷中心和AAHL合作,利用大腸桿菌表達的病毒N蛋白和P蛋白也建立了抗NiV血清抗體檢測技術,其步驟和AAHL與馬來西亞獸醫(yī)研究所合作開發(fā)的NiV間接ELISA抗體檢測的步驟*相似。
①血清處理。實驗人員必須穿防護服和手套,并且在將該密封板從*拿到外面在56~C加熱30rain之前,消毒他們的雙手和密封的板。在*里,在96孔板的孔上用含有0.5%(體積分數(shù))triton X-100和0。5%(體積分數(shù))tween-20的PBS按照1:5比例稀釋被測血清。密封此96孔板。然后,每份滅活的血清樣品取22.5PI+和用PBS稀釋100倍的對照抗原進行等體積*混合,并在18-22~C作用30min。然后,每份血清樣品加入405~tL封閉液(含有5%的卵清蛋白和5%的脫脂牛奶)使血清zui終稀釋100倍,在18~22尼帕病毒病作用30min,在兩個用NiV抗原包被的孔和在另外兩個用對照抗原包被的孔中分別都加入100ul這樣稀釋的待測血清。
②包被抗原。用PBS稀釋對照抗原和NiV抗原,要確保這兩種抗原蛋白質濃度相同??乖ǔO♂尩絣/4000-1/1000。但對每一批抗原,都應確定其合適的稀釋度。按照下面方法向NUNCMaxisorp 96孔微孔板中加入50gL對照抗原或NiV抗原:第1列、第3列、第5列、第7列、第9列、第11列的孔中加入NiV抗原,在第2列、第4列、第6列、第8列、第10列、第12列的孔中加入對照抗原,然后37℃振蕩1h,也可以在4℃過夜。
③封閉ELISA板。用含有0.5%tween-20的PBS沖洗ELISA板3次,再加入含有5%脫脂奶粉的PBS,37尼帕病毒病振蕩30min,封閉ELISA板。
④加被檢血清。用PBST沖洗板3次,并加入100uL處理的血清。在酶標A蛋白對照孔和底物對照孔中加入含有5%卵清蛋白和5%脫脂牛奶的PBS。37℃靜置1h后用PBST沖洗3次。
⑤在含有1%脫脂牛奶的PBST中稀釋酶標A蛋白,稀釋為原來的1/3000。仔細混勻后在每個孔(除底物對照孔)中加入100uL。在底物對照孔中加入100uL含有1%脫脂牛奶的PBST,37℃靜置1h后用PBST沖洗3次。
⑥準備底物溶液。在10ml 0.05mol/L磷酸緩沖液中溶解一片四甲基聯(lián)苯胺(TMB,1片lmg,Sigma公司, 目錄號T 3405),并加入2uL新鮮的H202。每孔中加入100uL底物溶液,在18~22℃孵育10min,后每孔加入100uLlmol/L的硫酸,終止反應。
⑦以底物對照孔為空白對照,測定各個孔的450nm處的OD值,并計算每一份血清樣品的在NiV抗原包被孔OD值(ODNiV和對照抗原包被孔中OD值(ODCON)之比(OD比)。
⑧結果判定:①OD比>2.0,并且ODNiv>0.2,判為陽性;②OD比>2.0,并且ODNiv<0.2,判為陰性;③OD比在2.0和2.2之間的應該判為疑似;④疑似和陽性樣品應該用VNT進行進一步檢測。
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