我公司為感謝朋友們長期以來的支持與厚愛,特選在雙十一前為咱們*共享:ELISA試劑盒試驗的閱歷。以下是我公司技術(shù)人員總結(jié)出的小閱歷供咱們參考:
包被原的性質(zhì)很重要
這關(guān)系到做出的抗體可不能夠被其識別,所以保存抗原很重要,做重組蛋白時,要在冰浴下緩慢融化。還有有的包被原或許不是蛋白,關(guān)于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被。
1、親和素生物素:先親和素先包被載體,參加生物素化的DNA,這種包被方法均勻、健壯,已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
2、脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑中溶解后參加ELISA板孔中,開蓋置冰箱過夜或涼風(fēng)吹干,待酒精蒸騰后,讓脂質(zhì)天然干固在固相表面。
3、小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
包被液的挑選
一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需求,包被原的特殊性也或許采用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)留意:
由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,ELISA試劑盒靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用,這種物理吸附對錯特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有穩(wěn)固的理論外也要實踐,看一下zui終可不能夠應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
封閉
繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的進程。封閉便是讓許多不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,然后架空ELISA后的過程中煩擾物質(zhì)的再吸附。
常用封閉劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉,能夠高濃度使用(5%-10%);ELISA試劑盒還有一些稀有用到的各種動物血清和酪蛋白等等。但zui終選用什么,要依據(jù)試驗具體來實踐。
洗刷板
能夠說在ELISA操作中,洗刷是zui首要的關(guān)鍵技術(shù)。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,為到達別離游離的和結(jié)合的酶標記物的意圖,鏟除殘留在板孔中游離的物質(zhì),以及非特異性地吸附的煩擾物質(zhì),在洗刷時又應(yīng)把這種非特異性吸附的煩擾物質(zhì)洗刷下來。所以在洗板時會有必定差錯,人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機在外),洗的不*或串了孔,對如此活絡(luò)的ELISA系統(tǒng)但是不小的影響。
加抗體標本(和二抗)
留意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用pbs稀釋,也可用封閉液去稀釋。如需加二抗,還要留意二抗的作業(yè)濃度,太高糟ta,太低則著色淺。
顯色
我們一開始做的時分,要挑選適合的顯色系統(tǒng)。留意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵,AP結(jié)合物可加疊氮鈉。每次做盡量要把陰陽空三個對照做好,如出現(xiàn)問題也好剖析。
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