大鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)定量檢測試劑盒(ELISA)
【試劑盒用途】
定量檢測大鼠血清、血漿、組織液及其它相關(guān)液體樣本中Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)的含量。
【檢測原理】
本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本加入到預(yù)
先包被大鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中,溫育足夠時(shí)間后,洗滌除去
未結(jié)合的成分,再加入酶標(biāo)工作液,溫育足夠時(shí)間后,洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底
物A、B,底物(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物,在酸的作用下
變成,顏色的深淺與樣品中大鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)濃度呈正相關(guān),450nm 波長下測定
OD 值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD 值,計(jì)算樣本中大鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)含量。
【試劑盒組成】
1 酶標(biāo)包被板12 孔×8 條7 顯色劑A 液6mL
2 標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL×6 管8 顯色劑B 液6mL
3 20 倍濃縮洗滌液25mL 9 終止液6mL
4 樣本稀釋液6mL 10 說明書1 份
5 特殊稀釋液6mL 11 封板膜2 張
6 酶標(biāo)試劑6mL 12 密封袋1 個(gè)
備注:標(biāo)準(zhǔn)品(1 號→6 號)濃度依次為:12、6、3、1.5、0.75、0.375 μg/L.
【需要而未提供的試劑和器材】
1、37℃恒溫箱
2、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
3、精密移液器及一次性吸頭
4、蒸餾水
5、一次性試管
6、吸水紙
【操作步驟】
1、準(zhǔn)備:從冰箱取出試劑盒,室溫復(fù)溫平衡30 分鐘。
2、配液:用蒸餾水將20 倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本:取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板,固定于框架上,分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、
待測樣本孔和空白對照孔,記錄各孔位置,在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL;待測樣本孔中先
2
加入待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL(即樣本稀釋5 倍);空白對照孔不加。
4、溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5、洗板:棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙
上拍干,如此重復(fù)洗板4 次(也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板)。
6、加酶標(biāo)工作液:每孔加入酶標(biāo)工作液50μL,空白對照孔不加。
7、溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
8、洗板:棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙
上拍干,如此重復(fù)洗板4 次(也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板)。
9、顯色:每孔先加入顯色劑A 液50μL,再加入顯色劑B 液50μL,平板混勻器混勻30s
(或用手輕輕震蕩混勻30s),37℃避光顯色15min。
10、終止:取出酶標(biāo)板,每孔加終止液50μL,終止反應(yīng)(顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn))。
11、測定:以空白孔調(diào)零,在終止后15 分鐘內(nèi),用450nm 波長測量各孔的吸光值(OD 值)。
12、計(jì)算:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD 值,計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣
本的OD 值,在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度,也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。zui終濃
度為實(shí)際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
【樣本要求】
1、樣本不能含疊氮鈉(NaN3),因?yàn)榀B氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑制劑。
2、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能立即
試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、樣本應(yīng)充分離心,不得有溶血及顆粒。
【注意事項(xiàng)】
1、實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
2、酶標(biāo)包被板開封后如未用完,應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
3、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照都做雙份檢測,取平均值,以減小實(shí)驗(yàn)誤差。
4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5 倍,計(jì)算結(jié)果乘以5 才是樣本實(shí)際濃度。
5、本試劑盒定量范圍為0.375-12μg/L,超過此范圍,為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計(jì)算所得,不做為準(zhǔn)
確定量結(jié)果,請用特殊稀釋液稀釋后測定準(zhǔn)確結(jié)果(0.375-12μg/L 范圍內(nèi)),乘以總稀釋倍數(shù)
即為樣本zui終濃度。
6、若顯色過淺,可適當(dāng)延長底物溫育時(shí)間。
7、為避免交叉污染,標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照每加一個(gè)就要更換一次吸頭;酶標(biāo)工作液、
樣本稀釋液和底物等公共組分,要懸臂加樣,不得碰到微孔;不得重復(fù)使用封板膜。
8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用,不同批號的試劑不得混用。
9、底物B 對光敏感,避免長時(shí)間暴露于光下。
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【操作程序總結(jié)】
準(zhǔn)備試劑,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃反應(yīng)30 分鐘
洗板4 次,加入酶標(biāo)試劑,37℃反應(yīng)30 分鐘
洗板4 次,加入顯色液A、B,37℃顯色15 分鐘
加入終止液
15 分鐘之內(nèi)讀OD 值
計(jì)算
【檢測范圍】
0.375μg/L - 12μg/L
【規(guī)格】
96T/盒
【貯藏】
2-8℃,避光防潮保存。
【有效期】
6 個(gè)月
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