ELISA試劑盒通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的,如血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等,不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準(zhǔn)確性的*步。
1、 血清
血清是zui常用于ELISA檢測的一類樣本,處理也比較簡單。
用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本,將試管或離心管室溫放置2小時或4℃一個晚上,使血清析出。(將試管或離心管傾斜放置,使液面橫截面增大,能使血清更大程度的析出。)4℃ 1000×g離心20分鐘,仔細(xì)收集上清。建議將血清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
采血過程中應(yīng)避免溶血,因?yàn)榧t細(xì)胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì),在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色,而導(dǎo)致檢測的不準(zhǔn)確性。同時也應(yīng)避免細(xì)菌污染,因?yàn)榫w內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。
2、 血漿
ELISA試劑盒用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本,標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃ 1000×g離心15min,取上清即血漿。將上清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本。 常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等,檢測時還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說明書,檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。
3、 細(xì)胞培養(yǎng)上清
取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管,1000×g離心20min,除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì),取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
4、 細(xì)胞裂解液
1) 吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基,用胰酶消化細(xì)胞,加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細(xì)胞可省略。
2) 收集細(xì)胞懸液,1000×g離心10min,棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS潤洗3次。
3) 加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細(xì)胞。通常6孔板一個孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。
4) 將樣品放入-20℃或-80℃,使樣品冷凍,再放室溫解凍樣品,反復(fù)凍融幾次,使細(xì)胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎,以達(dá)到裂解的目的。
5) 4℃ 10000×g 離心10min,除去細(xì)胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
5、組織勻漿液
1) 將組織樣本用PBS (0.01 [錨點(diǎn)] [錨點(diǎn)] M, PH 7.4) 沖洗,洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。
2) 將組織塊稱重,記錄后剪碎,碎塊應(yīng)盡量小,便于勻漿得更充分
3) 將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿,勻漿時置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量:PBS體積=1:9的比例勻漿,例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,檢測后計(jì)算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù))
4) 吸取勻漿液到離心管,4℃ 5000×g 離心5~10min,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。
6、 尿液、唾液等其他液體生物樣本
1000×g離心20min,取上清即可檢測。
ELISA試劑盒總的來說,因?yàn)镋LISA只能檢測可溶性蛋白的含量,所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體,沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。
為了保證檢測的準(zhǔn)確性,保存于-20℃或-80℃的樣本在1~6個月內(nèi)檢測;4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測。
另外,還應(yīng)保證樣本不含NaN3,因?yàn)镹aN3會抑制HRP的活性,從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。
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