實(shí)驗(yàn)原理
人淀粉樣蛋白770(APP770)ELISA試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒,使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑,zui終溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中APP770的量成正比
檢測范圍
0.10~6.2ng/mL
預(yù)期用途
僅用于研究,不能用于診斷
此試劑盒用于EDTA-血漿腦脊液和細(xì)胞上清中人APP770的定量檢測
試劑盒組成
1.微孔板,96T,包被有抗人APP OX2(351)兔子IgG抗體,親和純化
2.標(biāo)記抗體濃縮,30X,0.4ml,HRP標(biāo)記的抗人APP(R101A4)小鼠IgG 單抗Fab片段
3.標(biāo)準(zhǔn)品,0.5ml,2支,重組人APP770
4. EIA緩沖液,30ml,1%的BSA,含0.05%的吐溫20的PBS
5. 標(biāo)記抗體稀釋液,12ml,1%的BSA,含0.05%的吐溫20的PBS
6. 著色劑,TMB,15ml
7. 終止液,1N硫酸,12ml
8. 洗滌緩沖濃縮液,40X,50ml,0.005%吐溫20的磷酸緩沖液
準(zhǔn)備步驟
人淀粉樣蛋白770(APP770)ELISA試劑盒試驗(yàn)所需材料但試劑盒未提供
l 酶標(biāo)儀(450nm)
l 帶刻度的量筒與燒杯
l 孵箱(37℃±1℃)
l 吸水紙
l 稀釋試管
l 微量移液器和取樣吸頭
l 去離子水
l 坐標(biāo)紙(log/log)
l 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管
l 洗滌瓶
試劑準(zhǔn)備
1.洗滌緩沖液制備:先將洗滌濃縮液平衡至室溫,充分混勻,然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻,即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi),并于2周內(nèi)用完
2.標(biāo)記抗體的制備:用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍,即得。
例:如果只測一條板,8孔,則需要標(biāo)記抗體800ul(30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液,混勻,使用時(shí)每孔加100ul)
此步驟在實(shí)驗(yàn)開始前完成
剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi),保存在4℃
3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備:吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi),充分混勻,得到12.4ng/ml的人APP770標(biāo)準(zhǔn)品
4. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:準(zhǔn)備8個(gè)試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋,每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 6.2ng/ml
2號管 3.1ng/ml
3號管 1.55ng/ml
4號管 0.78ng/ml
5號管 0.39ng/ml
6號管 0.19ng/ml
7號管 0.10ng/ml
8號管 0ng/ml(試驗(yàn)樣品空白)
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號管混勻,然后從1號管吸取230ul加入2號管,依次連續(xù)稀釋,標(biāo)準(zhǔn)品范圍為6.2~0.10ng/ml
5. 樣品稀釋:樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有評估,我們建議,先用幾個(gè)不同稀釋比例的樣品進(jìn)行檢測,來確定樣品*稀釋比例
實(shí)驗(yàn)步驟
使用前,所有樣品應(yīng)平衡至室溫,大約30min,然后充分混勻,確保試劑質(zhì)量無變化,標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測同時(shí)進(jìn)行
試劑
檢測樣品
標(biāo)準(zhǔn)品
檢測樣品對照孔
試劑對照孔
檢測樣品100ul
稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(1-7管)100ul
EIA緩沖液(第8管) 100ul
EIA緩沖液100ul
蓋板,4℃下溫育過夜
洗板7次
酶標(biāo)抗體
100ul
100ul
100ul
-
蓋板,37℃下溫育30min
洗板9次
顯色劑
100ul
100ul
100ul
100ul
室溫避光溫育30min
終止液
100ul
100ul
100ul
100ul
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值
1) 確定好空白對照孔,并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2) 確定好樣品對照孔,檢測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔,然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。
3) 蓋板,4℃下溫育過夜
4) 用洗滌瓶洗板,在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒,棄去洗滌液。重復(fù)7次,zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機(jī)洗板時(shí),用洗板機(jī)洗四次后,再用洗滌瓶洗3次。
5) 每孔加100ul酶標(biāo)抗體,除試劑空白對照孔外
6) 蓋板,37℃下溫育30min
7) 按照步驟4)洗板9次
8) 將所需量的顯色劑加入到試管中,然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染,請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9) 室溫避光溫育30min,加入顯色劑后溶液顏色會變成藍(lán)色
10)在每孔加100ul終止液,此時(shí)溶液顏色會變成
11)擦去微孔板底部的污點(diǎn)或水滴,終止液加入后30min內(nèi),在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)
特別注意
1.試驗(yàn)樣品采集后應(yīng)立即檢測或是凍存,凍存的樣品避免反復(fù)凍融,檢測前應(yīng)在低溫下先將其*溶解混勻
2.試驗(yàn)樣品用EIA緩沖液稀釋
3.試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)做雙份檢測
4.試驗(yàn)樣品應(yīng)在中性PH范圍,有機(jī)溶劑的污染可能會影響檢測
5.只能用試劑盒提供的洗滌液洗板,否則會導(dǎo)致試驗(yàn)失敗
6.吸水紙上拍干微孔板,不能擦拭
7.TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處,因其對光敏感,且避免接觸金屬
8.加入終止液后30min內(nèi)必須酶標(biāo)儀讀數(shù)
人淀粉樣蛋白770(APP770)ELISA試劑盒結(jié)果計(jì)算
繪制曲線前,所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗(yàn)樣品空白值,包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
附:采用全自動酶標(biāo)儀檢測,只需檢測前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù),如坐標(biāo)參數(shù)(線性,半對數(shù))和計(jì)算方式參數(shù)(三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程),即可直接得到結(jié)果
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